Leica TCS SP8 SMD User Manual page 10

Contents
16.2.4
16.2.5
16.2.6
16.2.7
16.2.8
16.2.9
16.2.10
16.3 Measurements Step - Time Series for FLIM Measurement
16.3.1
16.3.2
16.3.3
16.3.4
16.3.5
16.3.6
16.3.7
16.3.8
16.3.9
16.3.10
17 Summarized Manual for FLIM Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .163
17.1 Prerequisites. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .163
17.2 Selecting Position for the FLIM Measurement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .163
17.3 Changing from Continuous to Pulsed Excitation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .163
17.4 Changing from Internal Detection on the SP8 to External TCSPC Detectors . . .164
17.5 Using Internal SP FLIM Detection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .164
17.6 Using FLIM Detectors at the NDD Position (HyD RLD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .164
17.7 Setting Suitable Scan Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .165
17.8 Optimizing the Photon Count Rate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .165
17.9 Selecting the Correct Laser Repetition Rate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .168
17.10 Starting FLIM Data Acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .170
17.11 Resulting Raw Data File and Documentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .170
17.12 Measuring the Instrument Response Function (IRF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .172
17.12.1
17.12.1.1
17.12.1.2
17.12.1.3
17.12.1.4
10
Changing the Pulse Frequency for Pulsed Diode Lasers
(405, 440, 470, 640 nm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .145
2-Laser PIE (405, 470, 640 nm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .146
Changing Pulse Frequency for White Light Lasers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .147
Setting the Pinhole. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .148
Optimizing FLIM Settings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .148
Count Rate Monitor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149
Loading and Saving FLIM-specific Instrument Parameter Settings . . . . . . . .149
at Multiple Points . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .150
FLIM Network Connection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .150
Definition of the FLIM Measurement File Names Transferred to
SymPhoTime . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .150
Defining a Single FLIM Image . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .152
Defining an xyz or xzy FLIM Stack. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .153
Defining an FLIM Time Series . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .154
Defining a Time Series of xyz or xzy FLIM Stacks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155
Defining an xy or xz FLIM Stack. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .157
Defining a Time Series of xy or xz FLIM Stacks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .158
Defining an xy or xz FLIM Stack. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .160
Control of FLIM Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .162
Preparing IRF Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .172
Estimating the IRF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .172
With Reflection Mode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .172
With Fluorescence Mode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .173
With SHG (Second Harmonic Generation - Possible for
MP Lasers Only) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .173