Benötigte Materialien & Rezepte; Elektrophoresepuffer - VWR Peqlab PerfectBlue Mini S Instruction Manual

Bedienungsanleitung PerfectBlue
BENÖTIGTE MATERIALIEN & REZEPTE

Elektrophoresepuffer

Im Allgemeinen müssen Elektrophoresepuffer die für die Elektrophorese nötigen Ionen bereitstellen und
für einen konstanten pH-Wert sorgen, damit das Zielmolekül die gewünschte Nettoladung aufweist
(Nukleinsäuren sind in alkalischem bis neutralem Milieu negativ geladen). Häufig enthalten sie außer-
dem Komponenten, welche das Zielmolekül vor Degradation schützen (z. B. EDTA, welches aufgrund
der Komplexierung zweiwertiger Kationen u. a. DNasen inhibiert). Soll die Elektrophorese unter denatu-
rierenden Bedingungen erfolgen (z. B. bei der Elektrophorese von RNA), enthalten Gel- und Laufpuffer
darüber hinaus Substanzen, welche die Bildung von Sekundärstrukturen verhindern. Im Folgenden wer-
den die beiden Elektrophoresepuffer TAE und TBE beschrieben, welche am häufigsten für die Elektro-
phorese von DNA unter nicht-denaturierenden Bedingungen verwendet werden. TAE-Puffer ist für
präparative Gele zu empfehlen, d. h. wenn die DNA im Anschluss an die Elektrophorese aus dem Gel
eluiert und weiterverwendet werden soll. Im Vergleich zu TBE sind mit TAE außerdem höhere Migrati-
onsgeschwindigkeiten und eine bessere Auftrennung von supercoiled DNA zu erzielen. Aufgrund der
deutlich geringeren Pufferkapazität von TAE ist für zeitlich ausgedehnte Elektrophoresen jedoch TBE zu
empfehlen, sofern die Pufferkammer nicht über ein Pufferrezirkulationssystem verfügt (wie z. B. die
PerfectBlue™ 'Revolution'-Systeme von VWR), welches die Ausbildung eines pH-Gradienten (alkalische
Anodenseite, saure Kathodenseite) verhindert. Da Agarose in TBE-Puffer außerdem feinere Poren und
eine festere Matrix bildet, wird die vom elektrischen Feld unabhängige Diffusion der DNA verringert
und eine höhere Bandenschärfe erzielt.
TAE (Tris-Acetat-EDTA) Puffer
1 x Arbeitslösung:
50 x Stammlösung (1 l):
TBE (Tris-Borat-EDTA) Puffer
0.5 x Arbeitslösung*:
5 x Stammlösung (1 l)**:
* Während für Agarosegele eine TBE-Konzentration von 0.5 x
elektrophorese häufig 1 x TBE eingesetzt, um den vergleichsweise kleineren Pufferreservoiren vertikaler Gel-
kammern Rechnung zu tragen.
** 5 x TBE-Stammlösungen können bei längerer Lagerung ausfallen. Sie sollten dann verworfen werden. Aufgrund
dieser Eigenschaft ist das Ansetzen höher konzentrierter Stammlösungen nicht sinnvoll.
VWR_v0617_D
Horizontale Minigelsysteme
TM
40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA
242 g Tris
57.1 ml Eisessig
100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
mit H O auf 1 l auffüllen
2
45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA
54 g Tris
27.5 g Borsäure
20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
mit H O auf 1 l auffüllen
2
21
ausreicht, wird für vertikale Polyacrylamid-