Agarose: Gelvolumen Und -Konzentration; Ethidiumbromid - VWR Peqlab PerfectBlue Mini S Instruction Manual

Bedienungsanleitung PerfectBlue

Agarose: Gelvolumen und -Konzentration

VWR bietet eine Reihe hochwertiger Agarosen an, die für verschiedenste Anwendungen geeignet sind
(siehe 'TECHNISCHER SERVICE & BESTELLINFORMATIONEN').
Das benötigte Gelvolumen errechnet sich nach folgender Formel:
Gelbreite (cm) x Gellänge (cm) x Geldicke (cm) = ml Agaroselösung
Abhängig von der Geldicke ergeben sich somit folgende Gelvolumina:
Modell
PerfectBlue™ Mini S
PerfectBlue™ Mini M
PerfectBlue™ Mini L ('Revolution')
Je nach Agarosegehalt des Gels werden Moleküle unterschiedlicher Größenbereiche optimal aufge-
trennt. Für besonders kleine Nukleinsäurefragmente werden hochprozentige Gele, für besonders große
Fragmente niederprozentige Agarosegele verwendet. Für die in der folgenden Tabelle angegebenen
größten bzw. kleinsten Fragmentlängen sollte allerdings die Verwendung einer Spezialagarose bzw.
eines Polyacrylamidgels erwogen werden, da sich eine 3 %ige Agaroselösung extrem schnell verfestigt
bzw. ein 0.3 %iges Agarosegel sehr brüchig ist.
Agarosegehalt (w/v)
0.3 %
0.5 %
0.7 %
1.0 %
1.2 %
1.5 %
2.0 %
3.0 %

Ethidiumbromid

Ethidiumbromid ist für den Nachweis von Nukleinsäuren in Gelen immer noch der am häufigst verwen-
dete Fluoreszenzfarbstoff. Aufgrund seiner Eigenschaft, zwischen die Basen eines Nukleinsäurestranges
zu interkalieren und somit dessen sterische Eigenschaft zu verändern, ist von einer stark mutagenen
Wirkung auszugehen. Da es sowohl hydrophile als auch hydrophobe Eigenschaften besitzt, müssen für
den Umgang mit Ethidiumbromid Maßnahmen getroffen werden, die sein Eindringen in lebende Haut-
schichten verhindern.
Zum Färben der Nukleinsäuren bereits während der Elektrophorese kann Ethidiumbromid der Gellösung
vor dem Gießen zu einer Konzentration von 0.1 bis 0.5 µg/ml beigefügt werden. Aufgrund seiner posi-
tiven Ladung wandert es allerdings während der Elektrophorese zur Kathode (negative Elektrode), sozu-
sagen 'der Nukleinsäure entgegen', wodurch sich ein inhomogener Hintergrund und eine ungleichmä-
ßige Färbung unterschiedlich langer Nukleinsäuren ergeben. Homogenere Färbeergebnisse mit gerin-
gem Hintergrund lassen sich erzielen, wenn das Gel im Anschluss an die Elektrophorese in einer Fär-
bewanne in Elektrophoresepuffer mit 0.5 µg/ml Ethidiumbromid für ca. 5 bis 20 min leicht wippend
inkubiert und anschließend für ca. 5 bis 20 min in Elektrophoresepuffer entfärbt wird.
VWR_v0617_D
Horizontale Minigelsysteme
TM
Gelgröße (cm)
7 x 8 (B x L)
9 x 11 (B x L)
12 x 14 (B x L)
Agarose (g)
0.3
0.5
0.7
1.0
1.2
1.5
2.0
3.0
22
Geldicke (cm)
0.25 0.5
14 ml 28 ml
25 ml 50 ml
42 ml 84 ml
Puffer (ml) optimaler Auftrennungsbereich (kb)
100
100
100
100
100
100
100
100
0.75 1.0
42 ml 56 ml
75 ml 100 ml
126 ml 168 ml
5 - 30
1 - 15
0.8 - 10
0.5 - 7
0.3 - 6
0.2 - 4
0.1 - 3
< 0.1